18. april 2011

Teknikker

Der er flere forskellige teknikker, man skal kende til, når man skal fremstille GMO. Læs her om marker assisted selection, kloning af transgen og agrobacterium tumefaciens.

Marker assisted selection

Molekylære teknikker indgår også i traditionel planteforædling

Moderne planteforædling bygger på viden om planters genetik og reproduktion. Ikke blot genmodifikation, men også den såkaldt traditionelle forædling benytter sig i vid udstrækning af molekylærbiologiske teknikker - dog ikke med henblik på at genmodificere. "Marker Assisted Selection" (MAS) er, som navnet antyder, en teknik til at udvælge, det vil sige til at afgøre, om et bestemt gen, protein eller træk er til stede i en bestemt plante. Det ønsker man eksempelvis at afgøre, efter at man har krydset en vild plante, der har et attraktivt træk, med en højtydende afgrøde, hvori man ønsker dette træk. Med mindre genet koder for et meget synligt træk (såsom farve), kan det være et større detektivarbejde at finde de planter, der har den rette kombination af gener/træk fra forældreplanterne. I MAS udnytter man, at der findes genetiske sekvenser, som er lette at identificere, og som med meget stor sandsynlighed "følges med" de bestemte gener/træk, man ønsker at følge (fordi de på kromosomet ligger tæt på de pågældende gener, og derfor sjældent adskilles fra disse gener pga. overkrydsning ved meiose). Disse let genkendelige træk/gener kalder man for "markører" (eng. "markers").

PCR opformering

Den mest anvendte teknik, hvor man bruger DNA-markører til af identificere planter med ønskede egenskaber, kaldes "SSR". Det står for "simple sequence repeats", som også kaldes "mikrosatelitter". Mikrosatelitter er DNA-sekvenser, der ikke koder for proteiner, og som består af en stribe basepar-gentagelser, såsom gentagelser af baseparret "CA" (før i tiden kaldte man den ikke-kodende del af arvemassen - som udgør langt størstedelen - for "junk-DNA"). Sådanne basepar-gentagelser er hyppige og ligger spredt over plante-genomet, og derfor kan man ofte finde en sådan sekvens, der ligger tæt ved den egenskab, man interesserer sig for. Det der gør mikrosatelitter egnede som markører er, at den specifikke sekvens er forskellig fra den ene mikrosatellit til den anden; for eksempel vil antallet af gentagelser ofte variere. Dermed fungerer hver unik mikrosatellit som et fingeraftryk for det gen, den følges med.

Når man krydser to planter med hver deres interessante (fx kommercielt vigtige) gener - såsom en afgrøde og en vild slægtning - er spørgsmålet, om man har været så heldig, at flertallet af de vigtige gener fra hver af forældrene er fulgt med til afkommet. Kan man afgøre, om en bestemt mikrosatellit er til stede i en plante, har man også med stor sandsynlighed afgjort, at det vigtige gen mikrosatelitten følges med, er til stede.

PCR opformering

Man identificerer disse mikrosatelitter ved at bruge PCR-teknikken. Princippet i PCR er, at man kan opformerer specifikke DNA-sekvenser så meget, at de bliver synlige. Hvilke DNA-regioner, der opformeres afhænger af, hvor de primere, man tilsætter, binder sig. Det skyldes, at primeren virker som et slags start/stop-element for DNA-polymerasen. Der er derfor udviklet primers, der kan igangsætte opformering af specifikke mikrosatelitter tæt på de interessante gener. Efter PCR-reaktionerne køres en elektroforese af reaktionsproduktet, hvilket adskiller DNAet efter DNA-strengenes størrelse. Princippet i elektroforesen er, at DNA-stykkerne (dvs. kopier af forskellige mikrosatelitter) sprøjtes ned i en gel, dvs. en geléplade. Gelen består af lange kulhydratpolymerer der binder vand. Når der ledes strøm igennem gelen bliver de negativt ladede DNA-strenge trukket mod plus-polen, men jo større de er, jo mere bremses de af kulhydratkæderne. Som resultat kan de mikrosatelitter, der findes i et bestemt afkom, ses som DNA-bånd. Bestemte bånds tilstedeværelse afslører altså, hvilke af de vigtige træk, der findes i afkommet efter en krydsning. Fordelingen af markører kan så bruges til at finde frem til det afkom, der i højest grad har den kombination af gener, man ønsker.

Kloning af transgen

Når man skal til at genmodificere, skal man bruge sit konstrukt i mange kopier

Der findes flere måder, hvorpå man kan "klone" et gen, dvs. fremstille en masse identiske kopier af det. En måde er at indsætte genet i et specielt ringformet bakteriekromosom, som kaldes et plasmid.

Plasmider kopieres af bakterien, når den formerer sig ved celledeling (mitose), hvorfor hver ny bakterie indeholder en kopi af plasmidet. Når bakterierne vokser og deler sig, kopieres genet altså med. Man kan indsætte genet i bakteriens eget plasmid. Men i mange tilfælde er det nemmere simpelthen at lave et separat plasmid i bakterien, da bakterieplasmiders størrelse kan gøre dem svære at arbejde med. Et ekstra plasmid, der indeholder transgenet, skal så også indeholde en "origin of replication", dvs. en DNA-sekvens, der får cellen til at kopiere plasmidet under mitose.

En anden teknik består i at bruge den såkaldte PCR-metode (polymerase chain reaction). Her er idéen, at man opvarmer DNA til over 90 grader, hvorved de to strenge i DNAet spontant adskilles ("denaturering"). Så afkøler man DNAet igen. Hvis man tilsætter lidt primer (et lille stykke komplementært DNA), kan enzymet DNA-polymerase nu bruge hver af enkeltstrengene som skabelon og påsætte DNA-baser, så hver af enkeltstrengene bliver dobbeltstrenget, og identisk med den oprindelige streng. Denne proces kan gentages - gennem cyklusser af opvarmning og nedkøling - til man har alle de kopier, man skal bruge (illustration)). PCR-teknikken blev opfundet i 1983, hvilket indbragte opfinderen, den amerikanske biokemiker Karry Mullis, en nobelpris. En af forudsætninger for opfindelsen var opdagelsen i 1969 af den termofile (dvs. "varmeelskende") bakterie Thermus aquaticus i de varme kilder i Yellowstone nationalpark i det vestlige USA. Det lykkedes få år senere at isolere bakteriens DNA-polymerase "Taq", der har den afgørende egenskab, at den forbliver stabil, selvom den bliver opvarmet til over de nødvendige 90 grader.

Agrobacterium tumefaciens

Naturligt talent for gensplejsning

Agrobacterium tumefaciens

Jordbakterien Agrobacterium tumefaciens (dansk navn: rodshalsgalle-bakterien) er i dag den mest benyttede vektor til transformation af planter. Fra naturens hånd besidder den evnen til at splejse sit DNA ind i planteceller, hvilket får planten til at vokse på en måde, der er gunstig for bakterien. Bakterien indeholder, som mange andre bakterier, et ekstra, ringformet kromosom, et plasmid, som i Agrobacterium kaldes for Ti-plasmidet - det står for "Tumor inducing plasmid" (knude- (eller galle-)fremkaldende plasmid).

Agrobacterium tumefaciens

Ved hjælp af svingtråde - flageller - kan den søge hen imod beskadigede rødder. Den kan registrere hvilken vej, koncentrationen af sukre og andre stoffer, der omgiver rødderne, stiger. Det bringer den hen til roden, hvor den kan koble sig til en rodcelle. Visse af de stoffer, planten afgiver, kan bakterien genkende med membranbundne receptorer, der aktiverer et genetisk "program" i bakteriecellen. Dette aktiverer de såkaldte "vir"-gener, som dels fører til, at tumor-DNAet (eller bare "T-DNAet"), fra bakteriens Ti-plasmid kopieres, dels at der udtrykkes nogle proteiner, der stabiliserer T-DNAet og hjælper det gennem cellevæggen. Andre proteiner sprøjtes ind i rodcellen, som hjælper T-DNAet videre ind i cellekernen, hvor det bliver integreret i rodcellens eget DNA. Når dette DNA aflæses af plantecellen, begynder den at fremstille plantehormoner, som får roden til at vokse uhæmmet og danne en såkaldt rodhalsgalle-tumor, hvor bakterierne trives. Dette ødelægger plantens vækst, og bakterien kan være til stor gene for landmænd, hvorfor man deaktiverer disse tumor-gener, når man bruger bakterien til gensplejsningsformål.