16. juni 2014

Reprogrammering af somatiske celler

Siden Yamanakas forskerhold opdagede, at det var muligt at reprogrammere somatiske celler til inducerede pluripotente stamceller (iPSC'er), ved at overudtrykke kun fire pluripotensgener, er der blevet forsket intensivt i at forbedre metoden og ikke mindst dens effektivitet
Forskere benytter sig i stor udstrækning af virale vektorer, når nyt DNA skal introduceres i celler, da metoden er enormt effektiv. Virale vektorer sørger for at integrere de medbragte gener på cellens genom og opretholder et stabilt udtryk. Brugen af virus til reprogrammering var derfor også det første valg. Det viste sig dog hurtigt, at den tilbageværende aktivitet af de integrerede pluripotensgener betød, at cellernes differentieringskapacitet var nedsat, og at de ved transplantation ofte udviklede tumorer i kimære dyr (Okita et al. 2007).

Man søgte derfor at finde nye metoder til reprogrammering. I stedet for virus lykkedes det forskerne at benytte pladsmider, som er små cirkelformede stykker af DNA. Fordelen ved at benytte plasmider frem for virus er, at de medbragte gener kun i begrænset grad integreres på cellernes genom. Ligeledes bliver plasmiderne nedbrudt og forsvinder i takt med cellernes deling. Hver gang cellen deler sig bliver den oprindelige mængde af plasmider i cellerne halveret indtil de ikke længere er tilstede. Man opnår derved et midlertidigt udtryk af pluripotensgenerne. På trods af den klare fordel ved plasmider var det kun muligt at opnå en reprogrammeringseffektivitet på 0,001%, mens effektiviteten for virus var 0,1-1% (Stadtfeld et al. 2010). Man mener, at årsagen til den lave effektivitet er, at kun få celler er modtagelige for reprogrammering, og at pluripotensgenerne ikke altid udtrykkes længe nok ved brug af pladsmider. Ydermere går mange celler til ved elektroporation (se neden for), og cellernes optagelse af pladsmiderne er ikke altid lige effektiv.

I Poul Hyttels laboratorium benyttes en metode, hvor tre plasmider transfekteres ind i hudceller (fibroblaster) ved hjælp af elektroporation. Dvs. at cellerne udsættes for en elektrisk spænding, der får fosfolipiderne i cellemembranen til at danne små porer, som pladsmiderne kan optages igennem. Metoden er på sin vis effektiv, selvom en stor del af cellerne får ødelagt deres membraner og går til.

Plasmiderne, der benyttes til reprogrammering af fibroblaster, indeholder pluripotensgener, der koder for transkriptionsfaktorer samt et microRNA og et short hairpin RNA (Okita et al. 2011). Transkriptionsfaktorer er små proteiner der binder til specifikke regioner på cellens genom og regulerer transkriptionen af bestemte gener. Man har tidligere fundet ud af at fx fibroblaster udtrykker specifikke transkriptionsfaktorer, der sørger for at opretholde celletype og cellespecifikke funktioner. Hvis man kunstigt udtrykker transkriptionsfaktoren MyoD fra muskelceller, vil fibroblasterne begynde at opføre sig som muskelceller og eksempelvis producere myofibre (muskelfibre) (Davis et al. 1987). Dette giver mulighed for kunstigt at ændre celletype. Transkriptionsfaktorene OCT3/4, SOX2, KLF4, og L-MYC er alle udtrykt i embryonale stamceller, og er med til at aktivere de gener, der opretholder pluripotens og selvfornyelse i cellerne.

Når plasmiderne bliver transfekteret ind i fibroblaster, begynder cellernes maskineri at producere transkriptionsfaktorer fra de medbragte gener, og herved reprogrammeres cellerne til stamceller. Udover de fire transkriptionsfaktorer koder plasmiderne også for et gen, der har betydning for cellernes selvfornyelse. Ligeledes bærer det ene pladsmid et short hairpin RNA, som begrænser produktionen af p53 i cellerne, og derved forbedrer reprogrammerings-effektiviteten (Marión et al. 2009). I celler fungerer proteinet p53 som en tumor suppressor, som forhindrer celler i at dele sig, hvis de har pådraget sig skader på DNAet, eller hvis deres telomere er for korte. p53 er derfor med til at forhindre, at skadede celler udvikler sig til cancerceller og danner tumorer. p53 udgør altså en barriere for reprogrammeringen af somatiske celler.


Figur 1. iPSC-koloni. © Hjalte Martin Larsen.

Når fibroblasterne er blevet reprogrammeret til iPSCer i laboratoriet, gennemgår de en lang række tests for at undersøge, om de er gode stamceller. Man tester fx for, hvorvidt pluripotens-generne ved en fejl spontant har integreret sig i genomet, hvorvidt de naturligt udtrykker stamcellemarkører, og om cellerne har potentialet til at differentiere til de tre forskellige kernelag, endoderm, mesoderm, og ectoderm. Disse karakteriseringer er baseret på de egenskaber, man kender fra embryonale stamceller. Først når cellerne er blevet grundigt undersøgt, og har undergået de nødvendige kvalitetstjek, kan de bruges til differentiering og videre arbejde i laboratoriet.

Ordliste

Plasmider: Cirkulære stykker af DNA, som kan benyttes som genetisk vektor til at introducere nye gener i celler. Plasmider findes naturligt i bakterier, der er i stand til at udveksle disse ekstra-gener med hinanden og dermed opnå nye egenskaber. Men der er altså ikke noget i vejen for at de også kan virke i eurkaryote celler – de vil dog normalt ikke blive kopieret sammen med de øvrige kromosomer under mitosen. Se mere om brugen af plasmider i case om genmodifikation af planter.

Kimære dyr: Dyr der indeholder celler med forskellig genetisk baggrund.

Short hairpin RNA (shRNA): En type af RNA der benyttes til at kunstigt at dæmme eller forhindre udtrykket af et bestemt gen i en process der kaldes gene silencing.

microRNA (miRNA): En type af RNA, som ikke koder for et gen, men i stedet fungerer som regulator af specifikke genudtryk.

Transfektion: Introduktionen af genetisk materiale såsom DNA eller RNA i celler.

Transkriptionsfaktorer: Proteiner der kan binde DNA og kontrollere, hvilke gener der er aktive i celler.

Referencer

Davis, R. L., Weintraub, H., & Lassar, A. B. (1987). Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell, 51(6), 987–1000.

Marión, R. M., Strati, K., Li, H., Murga, M., Blanco, R., Ortega, S., … Blasco, M. a. (2009). A p53-mediated DNA damage response limits reprogramming to ensure iPS cell genomic integrity. Nature, 460(7259), 1149–53.
Okita, K., Ichisaka, T., & Yamanaka, S. (2007). Generation of germline-competent induced pluripotent stem cells. Nature, 448(7151), 313–7.
Okita, K., Matsumura, Y., Sato, Y., Okada, A., Morizane, A., Okamoto, S., … Yamanaka, S. (2011). A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods, 8(5), 409–12.
Stadtfeld, M., & Hochedlinger, K. (2010). Induced pluripotency: history, mechanisms, and applications. Genes & Development, 24(20), 2239–63.